噬菌體展示技術(shù)篩選納米抗體
1. 納米抗體簡(jiǎn)介
1993年，Hamers-Casterman教授以及他的同事們?cè)隈橊劦难逯邪l(fā)現(xiàn)了一種與傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)不同的新型抗體：缺失輕鏈的天然重鏈抗體的可變區(qū)組成的單域抗體，該抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)（VHH）和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，分子量只有15KD，是傳統(tǒng)抗體的十分之一左右，是抗原結(jié)合片段（scFV，VH-VL）的二分之一左右，因此被稱(chēng)作納米抗體。
由于沒(méi)有輕鏈，納米抗體僅有3個(gè)屬于重鏈的抗原識(shí)別區(qū)域（CDRs 區(qū)）。為了彌補(bǔ)缺少的輕鏈CDRs的生物學(xué)活性，納米抗體在 CDR3部分增加了氨基酸長(zhǎng)度（16~18個(gè)氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)的傳統(tǒng)抗體的CDR3有8-15個(gè)氨基酸），以增加CDR的多樣性和特異性。另外，納米抗體的 CDR3 區(qū)域可形成一個(gè)大的暴露的凸環(huán)，像“手指”一樣延伸到抗原的縫隙或者裂口中，可以接觸到傳統(tǒng)抗體不能接觸的抗原表位。CDR3凸環(huán)中的一個(gè)半胱氨酸還可以與CDR1 或FR2 的 45 位點(diǎn)的半胱氨酸形成二硫鍵，可使納米抗體的生物結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，大大降低納米抗體與抗原結(jié)合所需能量，使得高親和力的納米抗體的獲得較容易。
2. 噬菌體展示原理
將待篩選基因插入噬菌體信號(hào)肽序列與主要衣殼蛋白基因VIII或基因III之間，每一個(gè)噬菌體只含有一個(gè)外源基因，每一個(gè)噬菌體只表達(dá)一種外源肽或蛋白，且呈現(xiàn)在噬菌體表面，而且不影響噬菌體的完整性。利用展示的多肽與目的蛋白（主要是抗體、抗等）或其他生物大分子親和的性質(zhì)可高效率地篩選出特異多肽。親和篩選的關(guān)鍵在于靶蛋白與短肽間的特異性結(jié)合，為了增加篩選的特異性，在篩選的過(guò)程中都是不斷地降低篩選配基的濃度，從而保證被篩選得到的短肽與靶蛋白有較強(qiáng)的親和力，即它們的結(jié)合是特異性的。
3. 納米抗體制備方案
納米抗體的獲得現(xiàn)在基本通過(guò)免疫羊駝，從羊駝體內(nèi)自身的抗體成熟階段來(lái)得到抗體基因，通過(guò)噬菌體展示篩選技術(shù)來(lái)從羊駝抗體庫(kù)中篩選得到高親和力的抗體序列。整個(gè)過(guò)程主要包括三個(gè)階段：
羊駝免疫：
一只羊駝可以同時(shí)免疫1-5個(gè)抗原，每次免疫總的抗原量保持在1-2mg之間，體積在2mL以下，純化制備的抗原與佐劑進(jìn)行乳化后對(duì)羊駝進(jìn)行免疫。在每次免疫前進(jìn)行采血用于免疫評(píng)價(jià)，采血從羊駝?lì)i部靜脈采取。
噬菌體文庫(kù)構(gòu)建：
分離免疫后的羊駝外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫(kù)，據(jù)設(shè)計(jì)的引物在cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增得到VHH片段。通過(guò)將抗體基因克隆到相應(yīng)噬菌體載體上可以將外源基因插入噬菌體基因適當(dāng)位置并隨著隨著噬菌體傳代，最終使外源蛋白展現(xiàn)在子代噬菌體的表面。
納米抗體篩選：
篩選的方法主要分為固相篩選和液相篩選兩種。通過(guò)生物淘洗法、競(jìng)爭(zhēng)法、消減法、選擇性感染篩選、延遲性感染篩選等方法可以對(duì)和靶蛋白強(qiáng)力結(jié)合的基因片段篩選出來(lái)。將靶點(diǎn)抗原或者帶有抗原的物質(zhì)直接/間接的固定在固體載體上，隨后加入噬菌體文庫(kù)和抗原相互作用。作用一段時(shí)間后用洗滌液洗滌固體載體表面，可以將未結(jié)合或非特異結(jié)合的噬菌體洗去。隨后用強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿破壞固體載體上抗原和陽(yáng)性噬菌體的結(jié)合，從而得到陽(yáng)性噬菌體溶液。將其侵染大腸桿菌進(jìn)、鋪盤(pán)、表達(dá)后進(jìn)行ELISA鑒定，一般重復(fù)進(jìn)行2-3輪的篩選即可獲得高親和力的納米抗體克隆。