IHC常見問題分析
1. 實驗原理
免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原抗體的特異性結合反應來檢測和定位組織和細胞中的某些化學物質的一門技術，它是免疫學和傳統(tǒng)組織化學相結合而形成的。帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)進行定性、定位、定量測定，免疫組織化學染色技術不僅有較高的敏感性和特異性，其特點是將形態(tài)學改變與功能、代謝變化結合起來，直接在組織切片、細胞涂片或培養(yǎng)細胞爬片上定位一些蛋白質和多肽類物質的存在，并可精確到亞細胞結構水平，結合電子計算機圖像分析系統(tǒng)或激光掃描共聚集顯微術等技術，對被檢測物質進行定量分析。
2. 實驗步驟
脫蠟與水化——抗原修復——淬滅——封閉——抗體孵育——DAB顯色——復染、脫水、透明、封片——鏡下觀察
3. 常見問題分析
二抗的信號放大：
常用抗體標記法，可分為生物素型和非生物型兩種類型。推薦使用非生物素型檢測系統(tǒng)。不建議使用生物素型檢測系統(tǒng)，原因是操作時間較長，需要進行內源性生物素封閉，但經(jīng)常會出現(xiàn)阻斷不完全的情況，就算阻斷完全則需要更長的時間。
組織固定脫水不佳：
可能原因是固定不佳或脫水過度，固定不佳解決方法：溶掉石蠟，二甲苯脫蠟2h——二甲苯2h——無水乙醇1h——80%乙醇1h后轉入70%甲醛乙醇固定液重新固定，時間根據(jù)組織大小確定。脫水過度解決方法：蠟塊粗修后放在冰水中浸泡或用5mmol/L鹽酸水浸泡或者用氨水等軟化劑軟化，再緩慢仔細地切片，切片時刻度比平時薄一些效果可能會更好。
脫片：
注意控制烤片溫度與時間，特殊組織需要進行特殊處理，對于脂肪含量豐富的組織必要時先進行脫脂處理，滅活內源性過氧化物酶操作中注意過氧化氫的濃度不宜過高，否則會產生氣泡，造成脫片。
切片出現(xiàn)水珠：
可能原因是切片受潮、透明劑與脫水劑互溶不佳或脫水不足，實驗過程中注意操作環(huán)境，防止切片受潮影響實驗結果，檢查脫水劑是否失效并及時更換脫水劑。
樣本個體差異：
表達量、表達位置的差異，可使用其他實驗方法，如WB、Flow等）對樣本先進行篩選、設立陽性對照（陽性病例或組織或陽性細胞器）； 樣本固定使用中性緩存福爾馬林NBF pH7~8為宜，濃度可選擇10%，新鮮組織要盡快放入固定液中固定、固定時間48h、為了保證固定徹底，需要對組織進行分割，組織塊不能太厚，影響固定效果。
固定劑的選擇：
常用的固定劑有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸鹽緩沖液，標本固定可使細胞內的蛋白質凝固，減少或終止內源性或外源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，更重要的是保證組織或細胞內的抗原不失去活性。不同的抗原對固定液的耐受程度不同，所以在實驗中可根據(jù)抗原特性選擇合適的固定劑。
抗原修復方法：
常用的修復方法有高壓加熱修復、微波修復和胰酶修復。其中高壓加熱修復方法簡便，易于操作，效果好，但需要嚴格把控修復溫度和時間，修復結束后讓其室溫冷卻，使蛋白自然復性；抗原修復液需要選擇合適的pH，使用時要過量，防止高溫條件使得液體蒸干，影響切片效果。
一抗和二抗的濃度和孵育時間：
IHC染色結果受一抗?jié)舛?、孵育時間和溫度的影響較大，在4℃下，染色反應較慢，背景顏色較淺， 37℃反應較快，時間較短，所以溫度過低或過高都會影響實驗結果，介于這兩者溫度之間，可選擇室溫進行孵育，同時室溫條件也適用于較多樣本的檢測。二抗一般室溫孵育時間是30 min。
DAB顯色問題：
背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間主要由顯微鏡下控制，當出現(xiàn)特異性染色較強而背景著色較淺時即可沖洗。如果出現(xiàn)DAB顯色時間很短顏色深，則需要降低抗體濃度，但也有可能是非特異性蛋白封閉不全，需要延長封閉時間；反之如果DAB顯色時間很長才出現(xiàn)陽性染色則可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長。對于較弱的DAB顏色有時可以采取加入金屬離子的方法進行增強。
邊緣效應：
1.組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫。解決辦法：制備優(yōu)質的膠片（APES或多聚賴氨酸），組織切片要盡可能切得薄一些，組織前期處理操作要規(guī)范，選擇較好的組織進行實驗。
2.切片上滴加的試劑未覆蓋均勻或未覆蓋到全部組織，邊緣的試劑少，容易變干，導致邊緣的試劑濃度比中心區(qū)域的高，而使得染色結果偏深。解決辦法：滴加試劑時要均勻且充分覆蓋到全部組織，為防止邊緣水分減少，滴加試劑時可以適當?shù)渭映鼋M織邊緣2mm左右，保證組織部分覆蓋均勻。用組化筆畫圈時，距組織邊緣3-4mm為宜，避免油劑對實驗結果的影響。
產生組織切片非特異性染色的原因：
1.抗體濃度高、孵育時間過長會增加背景著色，實驗時可縮短一抗或二抗的孵育時間，降低抗體濃度。
2.一抗用多克隆抗體容易出現(xiàn)非特異性著色的問題，所以建議使用單克隆抗體。
3.內源性過氧化物酶和生物素在含血細胞多的組織如肝臟、腎臟等組織中含量很高，防止產生非特異性染色則需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。
4.非特異性組分與抗體結合，可通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。
背景強的原因：
考慮一抗?jié)舛仁欠襁^高；調整DAB孵育時間；考慮血清封閉時間是否過短；適當增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)或者延長浸洗時間等。