Western Blot實驗操作指南
一：實驗原理
蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB )，是將蛋白質(zhì)通過電泳從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜（硝酸纖維素薄膜）或PVDF（聚偏二氟乙烯膜）膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的技術(shù)。
該技術(shù)中被檢測的特定抗原指目的蛋白。特異性抗體指一抗和二抗，使用“一抗”作為“探針”，標(biāo)記的二抗用來“顯色”。轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)后的 NC 膜或PVDF膜就稱為一個印跡。
二：實驗流程
主要包括以下幾個步驟：
1. 制膠：按照分子克隆上面的配方，依據(jù)實驗驗證蛋白的分子量大小選擇制備相應(yīng)濃度的SDS-PAGE膠。
2. 上樣：小心拔出樣品槽梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔，取出梳子后，以1×SDS電泳緩沖液沖洗加樣孔，并以此緩沖液充滿之。按照實驗需要和順序上樣。
3. 電泳：這個沒有具體的時間限制，只要分子量最小的蛋白跑到膠的底部即可。
4. 轉(zhuǎn)膜：根據(jù)膠的大小選擇合適大小的膜，將電泳分離的條帶從凝膠轉(zhuǎn)移至NC/PVDF膜上。常用的方法是電洗脫或電泳轉(zhuǎn)移，形成“負(fù)極-海綿-三層濾紙-膠-膜-三層濾紙-海綿-正極”轉(zhuǎn)膜結(jié)構(gòu)， 在施加電場后蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠中移出并吸附在膜表面。
5. 封閉：為了防止抗體和膜非特異性結(jié)合，加入封閉劑將其他未結(jié)合蛋白的區(qū)域進(jìn)行封閉。
6. 抗體孵育：用目標(biāo)蛋白的抗體（一抗）處理膜，漂洗除去未結(jié)合的抗體，膜上僅含有目標(biāo)蛋白結(jié)合的一抗。再用標(biāo)記的二抗進(jìn)行酶免疫定位。
7. 顯影：顯影的方法包括化學(xué)發(fā)光法以及生色底物顯影法。標(biāo)記HRP（辣根過氧化物酶）的二抗：化學(xué)發(fā)光底物：一般選用ECL發(fā)光法進(jìn)行實驗，ECL中含有H2O2和魯米諾，在HRP（辣根過氧化物酶）的作用下發(fā)出熒光來。 生色底物：HRP的生色底物顯影有DAB、4-CN、CN/DAB、AEC和TMB等。標(biāo)記AP(堿性磷酸酶）的二抗：生色底物：AP的生色底物顯影有BCIP、NBT和INT。
三：常見問題分析
WB實驗常會出現(xiàn)實驗結(jié)果不完美的狀況，總結(jié)WB可能遇見的問題，分析可能的原因及對應(yīng)的解決方案，是實驗成功的基石。下面我們列舉一些常見問題及應(yīng)用對策。
| 問題 | 可能原因 | 驗證或解決辦法 |
| 陽性條帶弱或沒有信號 | 蛋白樣本降解 | 蛋白提取時，保持低溫環(huán)境并加入相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。蛋白樣本建議加入上樣緩沖液煮沸變形后保存，避免反復(fù)凍存，盡快完成檢測。 |
| 抗原量不足 | 每泳道蛋白上樣量不低于20-30μg。 | |
| 樣本中所含目的蛋白表達(dá)量過低或無表達(dá) | 設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，則可能是樣本中不含目的蛋白或目的蛋白含量太低。可考慮增加樣本上樣量解決目的蛋白含量低的原因。 | |
| 轉(zhuǎn)膜不充分 | 可以用麗春紅染膜幷結(jié)合染膠（考馬斯藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)移到膜上或轉(zhuǎn)移過度，適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流。 | |
| 試劑之間不匹配 | 一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性。 | |
| 一抗失效 | 使用新鮮一抗，重復(fù)使用有效濃度會降低； 選擇在有效期內(nèi)抗體，幷選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液。 | |
| 抗體孵育不充分 | 優(yōu)化抗體孵育量，一抗建議4℃過夜孵育。 | |
| HRP 抑制劑 | 所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉。 | |
| 洗膜過度 | 洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用0.1%的弱去垢劑 Tween-20。 | |
| 出現(xiàn)多條非特異性條帶或條帶位置發(fā)生錯誤 | 細(xì)胞傳代次數(shù)過多 | 使用原始或傳代少的細(xì)胞株，或平行實驗。 |
| 蛋白樣本降解 | 使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑。 | |
| 體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾：乙?；?、磷酸化、甲基化、烷基化和糖基化 | 查文獻(xiàn)，使用去修飾的試劑使蛋白恢復(fù)其正確的大小。 | |
| 蛋白存在二聚體或多聚體 | SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10min，以增強(qiáng)蛋白質(zhì)解聚變性。 | |
| 抗體不純 | 使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶。 | |
| 一抗特異性不高 | 重新選擇或制備高特異性的抗體。 | |
| 二抗?jié)舛冗^高，產(chǎn)生非特性結(jié)合 | 降低抗體濃度，加二抗對照（不加一抗）。 | |
| 條帶背景較高 | 膜沒有均勻浸潤 | PVDF 膜轉(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕，轉(zhuǎn)膜前用緩沖液浸泡10min且一直保持膜的濕潤。 |
| 膜或者緩沖液污染 | 拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液。 | |
| 封閉不充分或封閉液不合適 | 延長封閉時間，考慮更換合適的封閉劑。 | |
| 抗體孵育濃度過高，孵育時間過長或溫度過高 | 優(yōu)化抗體孵育濃度和時間。 | |
| 抗體與封閉劑非特異性結(jié)合或反應(yīng) | 檢測一抗、二抗是否與封閉液反應(yīng)。 | |
| 洗滌不充分 | 增加洗滌次數(shù)。 | |
| 條帶形狀不好看 | 膠凝的不均勻，聚合不好 | 灌膠前將溶液充分混勻。 |
| 電泳時溫度過高 | 降低電流或電壓。 | |
| 樣品中含有不溶性顆粒 | 樣品充分?jǐn)嚢杌靹颉?/td> | |
| 電極不平衡或加樣位置偏斜 | 調(diào)整電極和加樣。 |