二抗選擇指南
抗體
也叫免疫球蛋白 (Ig)，是一種能特異性結(jié)合抗原的糖蛋白，而抗原是在易感染動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)。在體內(nèi)抗體是由于外源性分子的侵襲而產(chǎn)生。抗體以一個(gè)或者多個(gè) Y 字形單體存在，每個(gè) Y 字形單體由 4 條多肽鏈組成，包含兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈，輕鏈和重鏈?zhǔn)歉鶕?jù)它們的分子量大小來(lái)命名的。Y 字形結(jié)構(gòu)的頂端是可變區(qū)，為抗原結(jié)合部位。
任何一個(gè)抗體的輕鏈都可以分為κ或λ型（基于小分子多肽結(jié)構(gòu)上的差異），每一個(gè)抗體的重鏈則決定了它的類或型。
重鏈
哺乳動(dòng)物Ig的重鏈一共有五種，分別用希臘字母α、δ、ε、γ和 μ 來(lái)命名，相對(duì)應(yīng)組成的抗體就稱為 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM 五種抗體。不同的重鏈在大小和組成上有所區(qū)別，α和γ包含大約450個(gè)氨基酸，而μ和ε則有大約550個(gè)氨基酸。
輕鏈
哺乳動(dòng)物只有兩種輕鏈：λ型和κ型。每條輕鏈有兩個(gè)前后相連的結(jié)構(gòu)域：一個(gè)恒定區(qū)和一個(gè)可變區(qū)。輕鏈的長(zhǎng)度大約為 211~217 個(gè)氨基酸，每個(gè)抗體包含的兩條輕鏈總是相同的，對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)每一個(gè)抗體中的輕鏈只有一個(gè)型：κ或λ型。
Fab和Fc段
Fc 段，也稱恒定區(qū)，可以直接結(jié)合酶或熒光染料來(lái)標(biāo)記抗體，是在 ELISA 過(guò)程中抗體鉚釘在板上的部位，也是在免疫沉淀、免疫印跡和免疫組化中識(shí)別并結(jié)合二抗的部位。
Fab段，也稱可變區(qū)，正是這個(gè)區(qū)域特異性地識(shí)別抗原的表位。
二抗
一抗是針對(duì)抗原的抗體，二抗是針對(duì)一抗的抗體，即抗體的抗體。二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用；此外，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子，從而使信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。二抗可以耦聯(lián)有幾種不同的標(biāo)記，可以是酶，熒光素，或生物素。
由于二抗所具備的優(yōu)點(diǎn)使得其在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中得以應(yīng)用廣泛，如western blot（通過(guò)與特異性抗體結(jié)合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)），ELISA（以耦聯(lián)有酶的抗體或抗原為標(biāo)記來(lái)檢測(cè)特異性的蛋白質(zhì)，尤其是相應(yīng)的抗原或抗體），免疫組織化學(xué)（檢測(cè)組織中的特異性抗原），免疫細(xì)胞化學(xué)（通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞的抗原組成），流式細(xì)胞術(shù)（通過(guò)檢測(cè)激光所激發(fā)熒光來(lái)鑒定分離不同類型的細(xì)胞）及免疫沉淀（通過(guò)抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來(lái)分離相應(yīng)抗原）。
要選擇出一種最適用于您的應(yīng)用和研究的最佳二抗，建議考慮以下因素：
1. 種屬來(lái)源和種屬反應(yīng)性
種屬來(lái)源是指制備抗體的物種。主要根據(jù)一抗種屬來(lái)源決定二抗種屬來(lái)源，如一抗是小鼠來(lái)源，那二抗就買抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。所用二抗的種屬來(lái)源必須不同于一抗的種屬來(lái)源和反應(yīng)種屬。例如，如果一抗來(lái)源于兔，則不能使用來(lái)源于兔的二抗。
2．抗體的類別或亞型
二抗必須與一抗的類別或亞類相匹配。
多克隆一抗通常來(lái)源于兔、山羊、綿羊或驢，并且是 IgG 同型。因此，二抗通常為抗 IgG H&L（重鏈和輕鏈）抗體。
單克隆一抗通常來(lái)源于小鼠、兔和大鼠。例如，如果單克隆一抗為小鼠 IgG1，則需要抗小鼠 IgG 二抗，或者特異性較低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG 二抗。
3．完整抗體還是抗體片斷
整個(gè)IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。
F(ab')2片段：該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成，這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。
Fab片段：它們只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一般用來(lái)封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。
4．二抗的偶聯(lián)標(biāo)記
一般來(lái)講，偶聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過(guò)氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC，RRX，TR，PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于western blot和ELISA，常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（組織免疫化學(xué)，細(xì)胞免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。
5．純化方法
大多數(shù)二抗從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物血清純化獲得。親和純化是指將含有抗體的血清通過(guò)固相配體的多孔純化樹(shù)脂柱。親和配體會(huì)與抗體互相結(jié)合，之后血清中其他未結(jié)合的成分可經(jīng)過(guò)漂洗步驟去除，最后使用一種可破壞配體-抗體相互作用的緩沖液將抗體從樹(shù)脂柱上洗脫并回收（即純化抗體）。這種類型的純化方法是通過(guò)使用可識(shí)別抗體的配體（如蛋白G）或可被抗體識(shí)別的配體（如目標(biāo)抗原）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
使用蛋白G作為親和配體可純化血清中的所有抗體（主要是IgG），而不區(qū)分其抗原特異性。使用目標(biāo)抗原作為親和配體僅純化血清中的抗原特異性抗體（任意亞型的免疫球蛋白）。