實(shí)驗(yàn)室常見問題分析匯總
合成的DNA保存：干燥制品很穩(wěn)定，-20℃下可保存2年；溶解后的DNA于-20℃保存，最好是分份保存，避免反復(fù)凍融；溶液中的Oligo DNA在常溫下可放置3～4天。
合成的RNA保存：干燥制品存放于-80℃最好，-20℃下可保存2年；溶液狀態(tài)的RNA最好保存在-80℃，如無條件，也要保存于-20℃。
對合成DNA/RNA制品進(jìn)行定量：由于核酸在260 nm附近有強(qiáng)吸收，因此常根據(jù)此性質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)測定核酸溶液在260 nm的吸光度值，據(jù)此對核酸進(jìn)行定量，用OD值來表示。1個OD值的合成DNA/RNA的質(zhì)量約為33μg。將DNA/RNA溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使吸光度測定值與樣品濃度的關(guān)系在直線范圍內(nèi)，再根據(jù)原溶液的總體積與稀釋倍數(shù)計(jì)算該溶液的總OD值。
OD260/OD280<1.8：由于核酸在260 nm附近有強(qiáng)吸收，而蛋白質(zhì)在280 nm附近有強(qiáng)吸收，從生物體內(nèi)提取核酸時，常用OD260/OD280比值來評價核酸純度 (比值在1.8～2.0之間)，這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結(jié)果。而合成的DNA/RNA則不同，序列很短 (通常在20～30個堿基之間)，其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同，由于各種堿基的摩爾消光系數(shù)不同，因此不同堿基構(gòu)成的合成DNA/RNA制品的OD260/OD280比值也不同，例如當(dāng)序列中C、T堿基的含量高時，該比值會大大低于1.8。此外，序列中堿基的排列順序也影響該比值。所以不能根據(jù)OD260/OD280比值來評價合成DNA/RNA制品的純度。
引物修飾常見問題分析
引物修飾：常見的引物修飾包括有磷酸化（Phosphorylation）、生物素（Biotin）、地高新（Digoxigenin）、內(nèi)部氨基修飾、5'氨基修飾、3'氨基修飾、巰基（Thiol）、硫代（Phosphorthioate）、脫氧脲嘧啶（DeoxyUridine，dU）和脫氧次黃嘌呤（deoxyInosine，dI）等。
合成的熒光標(biāo)記探針保存：熒光探針必須避光保存；干品可于-80℃保存一年以上，無條件時可于-20℃保存；用RNase-free的TE（pH 8.0）buffer溶解探針，得到的探針溶液更穩(wěn)定，保存時間更長；避免反復(fù)凍融。
熒光定量PCR常見問題分析
SYBR-Green染料法與TaqMan熒光探針法：SYBR-Green染料法：染料能夠與DNA雙鏈結(jié)合，當(dāng)PCR擴(kuò)增的時候，染料能特異性地滲入結(jié)合到DNA雙鏈上，發(fā)射熒光信號，而沒有滲入的染料分子不會發(fā)射熒光信號，從而通過收集到的熒光信號，確定PCR產(chǎn)物的增加量。染料法特異性不強(qiáng)，只要是雙鏈DNA都可以發(fā)光，所以該方法適用于任何DNA，無需設(shè)計(jì)探針，采取雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，實(shí)驗(yàn)周期短，結(jié)果重復(fù)性好，靈敏度高。TaqMan熒光探針法：PCR擴(kuò)增時需要同時加入一對引物和一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別帶上一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，所以通過熒光信號的累積，可以監(jiān)測PCR產(chǎn)物形成。探針法設(shè)計(jì)探針對目標(biāo)基因有高特異性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，相對于SYBR Green法，靈敏度更高。
熒光定量PCR需要提供的信息：樣品（組織/細(xì)胞/RNA/cDNA）、物種信息、目的基因的序列、GeneBank編號；引物、內(nèi)參基因、對照組。
對照組和內(nèi)參基因：在QPCR中加入內(nèi)參基因校準(zhǔn)，可以消除不同樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄上可能存在的差別，從而獲得目的基因特異性表達(dá)的真正差異。QPCR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算的是相對表達(dá)量，需以指定的樣品（對照組）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對定量數(shù)據(jù)分析。
載體構(gòu)建常見問題分析
PCR：載體構(gòu)建大部分時候都要通過PCR的方法獲取目的片段，擴(kuò)增PCR時盡量選用高保真的PCR酶來進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增之前要了解目的基因序列信息，其次高質(zhì)量的模板對PCR成功與否也很重要，以質(zhì)粒作為模板的PCR相對來說最好擴(kuò)增，基因組DNA和cDNA相對來說較難獲取一些。
引物：引物設(shè)計(jì)中，很多軟件都可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，比如pirmer5，構(gòu)建過程中，選用哪種方法需要在引物設(shè)計(jì)的時候考慮到，一般常用酶切連接的方法，但也可以使用無縫克隆的方法。需要注意的是做酶切連接引物設(shè)計(jì)要注意加上保護(hù)堿基，保護(hù)堿基大部分加入4個堿基可以滿足大多數(shù)內(nèi)切酶，也可以參照限制性內(nèi)切酶保護(hù)堿基添加表加保護(hù)堿基。無縫克隆方法設(shè)計(jì)引物的時候要加入同源重組臂序列。
菌落PCR鑒定：做菌落PCR鑒定的時候引物一般選擇載體上的通用引物來鑒定，因?yàn)檫x用目的片段兩端的引物可能會出現(xiàn)假陽性；操作方法一般是在小的EP管培養(yǎng)4小時左右，挑取單克隆，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁的情況時，即可進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定完成后測序驗(yàn)證，PCR過程可能會發(fā)生突變，所以多送幾個克隆可以保證我們所要的克隆順利獲得。
抗體選擇常見問題分析
一抗選擇：① 分析自己實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法。根據(jù)說明書選擇抗體適用的分析類型，如：可以應(yīng)用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。 ② 分析自己實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本的種屬。一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證過適用于何種動物或人的標(biāo)本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等動物的標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)。 ③ 分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性。抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述， 如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FCM流式檢測活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。④ 抗體宿主物種的選擇。對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。
二抗選擇：① 一抗的種屬來源。二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源。② 一抗的類別。二抗還需與一抗的類別或亞類相匹配，這通常是針對單克隆抗體而言。③ 二抗的耦聯(lián)標(biāo)記。一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。
特殊抗體保存：聯(lián)抗體酶永遠(yuǎn)保存在 4℃，避免冷凍；偶聯(lián)抗體需要在棕色管中或使用錫箔紙避光4℃保存，尤其是熒光抗體，對光極為敏感；IgG3的同型對照，永遠(yuǎn)保存在4℃，避免冷凍。注意絕對避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成，從而降低抗體的結(jié)合能力。
IHC常見問題分析
邊緣效應(yīng)：① 組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。 ② 切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。
產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因：① 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。② 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體。 ③ 內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。④ 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果。
背景強(qiáng)的原因：考慮一抗?jié)舛雀?；調(diào)整DAB孵育時間；考慮血清封閉時間是否過短；適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時間等。
WB常見問題分析
目的蛋白難顯影信號較弱：① 抗體濃度較低，需要增加抗體的濃度，延長孵育時間；② 轉(zhuǎn)膜效率低，轉(zhuǎn)膜緩沖液的pH值若與目的蛋白等電點(diǎn)相近則需要提高pH值；轉(zhuǎn)膜時是否有降溫處理；把握好轉(zhuǎn)膜的時間，電壓等； ③ ECL量不足或淬滅較快，則要提高ECL的量，并避光孵育膜。
結(jié)果背景過高：① 封閉問題：封閉液的濃度不足，提高封閉液的濃度，封閉液需要完全覆蓋膜；封閉時間需要1小時以上，或者4℃封閉過夜。② 抗體問題：抗體的非特異性結(jié)合，抗體濃度過高，孵育時間過久也會造成如此結(jié)果。③ 洗脫問題：提高洗膜次數(shù)及時間。所有處理膜的過程中，切勿使膜干掉。④ 顯色時化學(xué)顯色底物過多：按說明書加顯色底物。
結(jié)果條帶出現(xiàn)寬窄不一：① 膠制備的不好，凝膠聚合不均勻：制膠時加入TEMED后，立馬混合均勻，盡快灌膠，灌膠時從一角注膠，動作輕緩。 ② 膠板底部確保無氣泡，有氣泡，需要趕走氣。③ 拔梳子時，將孔齒弄歪曲，或孔中殘留的膠未沖洗掉，會導(dǎo)致上樣帶扭曲。④ 電泳液過少，氣泡進(jìn)入上樣孔，增加了電阻。⑤ 上樣量一定要一致。上樣量不宜過大，上樣要迅速，否則引起樣品擴(kuò)散，容易導(dǎo)致條帶連在一起。
ChIP常見問題分析
碎裂染色質(zhì)的濃度過低：染色質(zhì)制備使用的細(xì)胞或組織不夠，或細(xì)胞/組織裂解不完全，如果染色質(zhì)制備物的 DNA 濃度接近于 50 μg/ml，則向每次 IP 添加額外的染色質(zhì)，以確保每次 IP 至少產(chǎn)生 5 μg，然后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。交聯(lián)前，對單獨(dú)平板上的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)量。在超聲處理前后，用顯微鏡觀察細(xì)胞胞核，以確認(rèn)胞核是否完全裂解。
樣品輸入對照組 PCR 反應(yīng)中無產(chǎn)物或產(chǎn)物很少：添加至 PCR 反應(yīng)的 DNA 不足或條件不是最佳，向 PCR 反應(yīng)中添加更多 DNA 或增加擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。使用來源于交聯(lián)和碎裂染色質(zhì)的純化 DNA 來優(yōu)化針對實(shí)驗(yàn)用引物組的 PCR 條件；添加用于免疫沉淀的染色質(zhì)不足，或染色質(zhì)被過度碎裂，建議每次免疫沉淀添加 5–10 μg 染色質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)抗體 IP PCR 反應(yīng)中無產(chǎn)物：添加至 PCR 反應(yīng)的 DNA 不足，建議向 PCR 反應(yīng)中添加更多 DNA 或增加擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)；添加至 IP 反應(yīng)的抗體不足，建議增加添加至 IP 反應(yīng)的抗體量。
流式細(xì)胞術(shù)常見問題分析
熒光信號弱：可能的原因是處理未充分誘導(dǎo)靶標(biāo)表達(dá)，建議對每個靶標(biāo)進(jìn)行成功和可測量的誘導(dǎo)，優(yōu)化處理?xiàng)l件。如果使用的是PBMC，避開冰凍樣品，在可能的情況下，分離新鮮細(xì)胞。對照選擇未刺激/未處理的對照、同型對照、單獨(dú)細(xì)胞（未染色）對照、陽性對照。如果目的靶標(biāo)為胞內(nèi)靶標(biāo)，確保使用合適的固定和通透實(shí)驗(yàn)步驟。根據(jù)靶標(biāo)以及是否同時進(jìn)行表面標(biāo)記物染色，可能需要不同形式的固定和通透處理。熒光信號弱或者沒有熒光信號還要考慮熒光物質(zhì)的大小、構(gòu)象和穩(wěn)定性。
紅細(xì)胞裂解不完全：可能是0.1% Triton X-100 溶液可能不新鮮，應(yīng)使用新鮮試劑，并嚴(yán)格遵循流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)步驟。
高背景：抗體太多時使用建議的抗體稀釋度，使用較低的細(xì)胞數(shù)時，可自行進(jìn)行滴定?？贵w染色避免使用生物素化抗體。在進(jìn)行胞內(nèi)染色時，由于使用鏈霉親和素或抗生物素二抗偶聯(lián)物檢測胞內(nèi)自然存在的內(nèi)源性生物素，這些很容易導(dǎo)致較高的背景水平。
存在死細(xì)胞：在進(jìn)行活細(xì)胞表面染色時，使用活細(xì)胞鑒定染料對死細(xì)胞設(shè)置門控。但對固定細(xì)胞完成染色時，使用可固定的活細(xì)胞鑒定染料，這種染料能經(jīng)受固定處理，可在胞內(nèi)染色時結(jié)合使用。