載體構(gòu)建常見(jiàn)問(wèn)題分析
一：何為載體
載體（Vector） ，指在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。載體目前有三大類(lèi)，分別是質(zhì)粒載體、噬菌體載體與病毒載體。
一個(gè)理想的載體至少應(yīng)具備下列五個(gè)條件：
(1)具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性或親和性，以提高載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的效率；
(2)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使得外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳；
(3)具有較高的外源DNA的載裝能力，以滿(mǎn)足長(zhǎng)片段的克隆；
(4)具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)，有利于外源基因的拼接插入；
(5)具有合適的選擇性標(biāo)記，便于重組DNA分子的檢測(cè)。
二：實(shí)驗(yàn)原理
載體構(gòu)建（vectorconstruction），為把DNA分子運(yùn)送到受體細(xì)胞中去，必須尋找一種能進(jìn)入細(xì)胞、在裝載了外來(lái)的DNA片段后仍能照樣復(fù)制的運(yùn)載體。理想的運(yùn)載體是質(zhì)粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。載體構(gòu)建即是構(gòu)建含外源DNA的質(zhì)粒。主要包括已有載體多克隆位點(diǎn)MCS的改造和已有載體啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、篩選標(biāo)記等功能元件的改造。載體構(gòu)建完成后可利用PCR原理進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
三：實(shí)驗(yàn)步驟
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四：容易遇到的問(wèn)題分析
1. 克隆基因的酶切位點(diǎn)：
(1) 對(duì)目的基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)掃描分析，選擇合適的酶切位點(diǎn)。雙酶切時(shí)盡量選擇酶切溫度相同，buffer一致，雙酶切效率高的兩個(gè)內(nèi)切酶；
(2) 在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，保護(hù)堿基加入的數(shù)量要合適，選擇切割率高的相應(yīng)堿基。
2. 目的片段的擴(kuò)增：
(1) 條帶不單一：設(shè)計(jì)的引物不特異，適當(dāng)改變引物序列長(zhǎng)度；
(2) 無(wú)條帶：引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤或退火溫度不合適；檢查引物設(shè)計(jì)是否合理，是否重新設(shè)計(jì)；設(shè)置問(wèn)題梯度，選擇最合適的退火溫度；
(3) 引物形成二聚體：重新設(shè)計(jì)引物或適當(dāng)提高退火溫度。
3. 載體酶切：
(1) 酶切質(zhì)粒的純度與濃度要好；
(2) 如果雙酶切的兩個(gè)酶的最適溫度不同，建議單酶切，回收之后再使用另一個(gè)酶進(jìn)行酶切，過(guò)夜。
4. 連接片段：
(1) 連接比例：酶切產(chǎn)物回收后，利用瓊脂糖凝膠電泳比較載體與目的片段的亮度，確定體積比；
(2) 連接溫度和時(shí)間：室溫條件下2小時(shí)，如果后續(xù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性克隆較少可選用16℃過(guò)夜連接以提高連接成功率；
(3) 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組情況相近：載體自連或沒(méi)完全切開(kāi)，增加酶量或延長(zhǎng)酶切時(shí)間、減少所切載體的量、改變連接比等。
5. 菌落提取與PCR：
(1) 多次PCR均無(wú)陽(yáng)性克?。杭訇?yáng)性過(guò)高，可能是由于抗體失效，更換培養(yǎng)皿；
(2) 陽(yáng)性對(duì)照無(wú)條帶：酶失活或試劑有問(wèn)題，換新的試劑重新進(jìn)行PCR；
(3) 陰性對(duì)照有條帶：引物或試劑被模板污染，將所有試劑換新。
6. 酶切鑒定失敗：
(1) 酶失活導(dǎo)致酶切失敗，增加陽(yáng)性對(duì)照，確定酶是否成功酶切；
(2) 質(zhì)粒濃度不夠，重新轉(zhuǎn)化到高拷貝的細(xì)菌中，再重新提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
7. 表達(dá)鑒定：
(1) 載體質(zhì)粒為單順?lè)醋?，且啟?dòng)子位于多克隆位點(diǎn)之后。要在擴(kuò)增目的片段時(shí)，引物必須含有起始密碼子，否則無(wú)法表達(dá)相應(yīng)的蛋白；
(2) 注意細(xì)胞系的狀態(tài)與轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率可以使用帶熒光標(biāo)記的載體檢測(cè)。